基础研究到临床试验1

蕲蛇酶的基础研究到临床试验

王晴川刘广芬教授(福建医科大学蛇毒研究所福州350004)
    摘要蕲蛇酶系从尖吻蝮(Dicnagkistrodonacutus)蛇毒中分离纯化的一种凝血酶样酶，分子量27,000±3,000Da。基础与临床研究表明，具有降低血中纤维蛋白原浓度，抑制血小板聚集，预防血栓形成和溶解血栓作用，毒性较低。Ⅱ、Ⅲ期临床试验，对急性脑梗塞总有效率分别为92.2%和94.2%，不良反应少，证明是安全有效的新药。
    关键词 蕲蛇酶蛇毒尖吻蝮凝血酶样酶急性脑血栓抗血栓药
    National Second ClaSS New Drug Antithrombotic agent—AClitObin，basiC research and CliniCal investigation
WangQing—ChuanLiuGuang—Fen
(Laboratory Of Venom Research，Fujian Medical University，Fuzhou 350004)
    ABSTRACT Acutobin is a thrombin—like．enzyme purified from Dienagk—istrodonacutus suake venom with molecular weight 27,000±3,000 Da．Basic and clinical investigation showed that it ssessed Of lowering fibrinogen level in blood，inhibiting platelet aggragation，antithrombotic effct and low toxicity．Ⅲ and Ⅲ stage Of clinical test in acute ischemic strokeproved that it is an effectiveand safe drug for acute ischemic stroke with clinical improvement by 92.4%and 94.2% Of the cases respectively and without Obvious side effects．
    KEYWORDS Acutobin Snakevenom Dienagkistrodon acutus Thrombin—like
enzyme Acute ischemicstroke Antithromboticdrugs
    蕲蛇酶是从尖吻蝮(Dicnagkistrodon acutus)蛇毒中分离、纯化的凝血酶样酶(Thrombin—like enzymecs)的制剂名称，是用于防治血栓性疾病的新药，已经国家药品监督管理局审批为化学药品二类，其药学性质、临床前药理、药代动力学和毒性以及临床治疗应用等各项研究分述如下。
    一、药物性质
    1．药物来源
    本品系用尖吻蝮(即本草纲目所载的蕲蛇，俗称五步蛇)蛇毒冻干粉，用离子交换柱层析和凝胶过滤方法分离、纯化制成。母液用0.9%NaCI稀释，滤过除菌，经证明无菌、无热原后灌封安瓿，每支1ml，含0.75AU(蕲蛇酶单位)。
    2．理化性质
    母液用碱性不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)检定，显示一条区带，并测定分子量，为27±3kD，等电点(p1)在4.0—5.0，是一种糖蛋白。
    蕲蛇酶溶液及注射液的稳定性研究表明，该酶在10℃左右贮存3年活力未减。置50℃水浴加温1h活力未减，置80℃水浴加温1h，活力尚余一半。室温放置48个月(福州气候夏天可达38℃)，外观色泽、pH值、澄明度、蛋白含量及酶活力均无明显变化，40℃加热或2000lux光照，连续10天，酶活力只分别减少2～3%以内。说明该制剂较耐热，对光亦稳定，另将制剂的pH降低到2或上升至12，虽然活力明显减退，但将其调回到pH6—7活力大部恢复。
    蕲蛇酶注射液用分光光度法测定，在波长280±lnm处有最高吸收峰，注射液的吸收度在0.15±0.004。采用Lowty法检测，其注射液的蛋白含量为100±15ug.ml^-1。
    本品具有凝血酶样酶作用，如以凝血酶活力作为效价指标，则1蕲蛇酶单位(AU)相当于人凝血酶0.23～0.3国际单位。
    二、药理学研究
    1．与治疗作用有关的主要药效学
    (1)凝血酶样酶作用，本制品与凝血酶类似，体外实验能使纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，但不激活凝血因子XⅢ，故产生的是不交联的纤维蛋白微凝块，因而在体内易被降解清除。给犬0.75AU·kg^-1·iv和家兔2AU·kg^-1·iv能明显降低血浆纤维蛋白含量而起抗凝血及抗血栓作用。肝素能对抗凝血酶的作用。但不能对抗本品。
    (2)抑制血小板聚集功能
    体外实验，蕲蛇酶用量在0.1～0.8AU／ml浓度下，对人的富血小板血浆(PRP)不引起聚集反应：在37℃下与PRP温孵3min，在0.06～0.12AU／ml浓度下能抑制ADP、胶原、肾上腺素和凝血酶诱导的血小板聚集，并呈量效关系。在体实验，人(0.75AU)、犬0.75AU／kg)及家兔(1AU／kg)静脉注射，对凝血酶诱导的聚集均有抑制作用。
    (3)抑制动物实验性血栓形成(防栓作用)
    大鼠颈动脉—静脉迥路的动脉血栓模型，用蕲蛇酶2AU·kg^-1·iv，阿斯匹林100mg·kg^-1·iv作阳性药对照，大鼠下腔静脉注入兔脑粉浸液诱发的静脉血栓模型，用蕲蛇酶2和4AU．kg^-1·iv，同时用尿激酶10,000u／kg作阳性药对照。三种血栓模型的形成均被本药抑制，抑制强度与剂量呈量效关系。
    (4)动物实验性血栓溶解作用
    静脉血栓：家兔耳缘静脉注入凝血酶形成血栓后30min，iV蕲蛇酶2和4AU／kg两个剂量，均使血栓消褪时间明显缩短，并呈量效关系。大剂量组比阳性对照药尿激酶(3X10⁴u·kg^-1)溶栓作用更强。
    动脉血小板性血栓：给家兔颈总动脉内缝人一丝线，经2h形成血小板性血栓后，iv蕲蛇酶2和4AU·kg^-1，经4h后给药组血栓重量明显减轻。对照药尿激酶(5X10^u·kg^-1)无效，因尿激酶能促进血小板聚集^[6]。
    脑血栓：给家兔和大鼠iv蕲蛇酶1和2AU·kg^-1，对家兔及大鼠的实验性脑血栓均有明显促消褪作用，使血栓数目减少，脑组织对伊文思蓝通透性降低而使伊文思蓝含量下降。后者表明蕲蛇酶对血栓再通后引起的脑水肿亦有减轻作用。
    (5)体外纤维蛋白溶解试验
    应用纤维蛋白平板试验方法，证明蕲蛇酶在试管内无直接溶解纤维蛋白作用，尿激酶则有效。
    (6)优球蛋白溶解时间(ELT)测定
    家兔iv蕲蛇酶2和4AU·kg^-1，均使ELT明显缩短。
    (7)促使血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活物(t—PA)
    给大鼠iv蕲蛇酶2和4AU·kg^-1，可使血浆t—PA含量明显增加。
    (8)蕲蛇酶抗血栓作用原理初步设想
    血栓的形成涉及许多病理因素的参与，主要与血管内皮细胞的损伤，血小板聚集和血液
凝固与纤维蛋白溶解平衡失调有关。蕲蛇酶可能通过降低血中纤维蛋白浓度，抑制血小板
聚集和促使血管内皮细胞释放t—PA，而发挥抗血栓作用。
    2．一般药理作用研究
    (1)神经系统：给犬及家兔各12只分别一次ivl.5和4.0AU·kg^-1的蕲蛇酶注射液，每天一次，连用4周，两种动物均无出现兴奋、烦燥不安或镇静、嗜睡不活泼等异常现象，喂饲时反应如常(犬抢食、摇尾、兔抢食)。另用家兔11只，用乌拉坦浅麻醉，记录额一枕，额一额表面脑电图，蕲蛇酶0.75和2AU·kg^-1一次静脉慢速注入(10min注毕)，均未记录到异常的脑电变化。
    (2)心血管和呼吸系统：犬8只，戊巴比妥钠静脉麻醉，记录颈动脉血压，呼吸及描记心电图。分别静脉一次注入蕲蛇酶0.75和1.5AU·kg^-1，观察8h，血压、心率、呼吸及心电图未记录到明显改变，其中一只犬药后8h出现R波电压稍降、T波电稍片。两只狗出现血压轻度下降。家兔8只，分为两组，分别每天一次iv蕲蛇酶注射液1.5和4.0AU·kg^-1，连用28天，结果两个剂量的心电图均未记录到异常现象。
    三、蕲蛇酶药代动力学研究(动物)
    1．药代动力学
    和2AU·kg^-13种不同剂量后，测定24h内血药浓度变化，在微机上用PRBP—NI程序拟合。结果呈三室开放模型特征，其T_1／2α相为4min，β相为50min，γ相为18h，Vd为88ml·kg^-1，三个剂量的T_1／2α，β，γ各相间无显著差异，说明在此剂量范围内，蕲蛇酶按一级动力学过程消除。
    2．分布
    用I¹³¹标记蕲蛇酶，研究其大鼠体内的分布。结果显示药后2h分布量多的是肾，其次为肾上腺、脾、肺、肝。药后4h分布最多的仍是肾，其次是肝及脾，浓度比药后2h高2倍。心、脑、骨骼肌、胃肠道及睾丸等分布很少，尿中亦多。此说明本品主由肾排出，肝、脾、肺血流丰富的脏器摄取亦多。
    3．排泄
    用I¹³¹标记蕲蛇酶，研究其在大鼠体内的排泄情况。结果表明在24h内由粪及尿排出约80%，其中由尿排出占86%，即为给药量的69%左右。
    4．与血清蛋白结合率
    I¹³¹标记蕲蛇酶与家兔血清混合放置60min后，用Scphakcx G-75柱分离I¹³¹标记蕲蛇酶和蛋白结合物。结果表明结合率为30.36%。
    四、毒性研究
    1．急性毒性
    (1)LD₅₀测定：静注LD₅₀测定采用昆明种小鼠，体重20±1.3g，♂♀各半，分7个剂量组，每组10只分别iv不同剂量的蕲蛇酶，观察7天内死亡情况。按简化机率单位法计算LD₅₀及其95%可信限为101.6(84.4—122.3)AU．kg^-1。
    蕲蛇酶皮下注射毒性：两组小鼠(每组10只)皮下分别注入1173.和1593AU·kg^-1，7天内未见动物死亡，亦无明显反应，7天后处死剖析，仅见注药皮下血管扩张，但重要脏器(心、肺、肝、肾、胃肠系膜)未见异常。由于用量已达静脉LD的20倍，又非本药的临床给
药途径，故未进一步作皮下注射的LD₅₀测定。
    肌肉注射于小鼠(10只)1000AU·kg^-1亦无毒性表现。
    (2)中毒症状：受试动物引起死亡者均在24h内发生，中毒表现在厌食、不活动、毛松、死亡者死前有鼻出血，剖检见两肺有严重瘀血和出血斑，但心、肝、肾、胃肠系膜则未见瘀血或出血。未死亡者，48h后食欲恢复、活动亦趋正常，药后7天剖检，两肺未见出血斑点。
    2．长期毒性
    犬和家兔各12只，各均分为3组，一组给与生理盐水，另2组分别给于高、低两种剂量的蕲蛇酶。犬分别为1.5和0.5AU·kg^-1·iv兔为3.6和1.2AU·kg^-1·iv，均连用4周(临床拟定疗程为7天的4倍)。于药前、药后14天，28天各分别采血一次，测定血液三大常规和肝、肾功能、血液凝固系统的主要指标和血小板聚集功能，每日记录动物活动、食欲、排泄、等情况。结果在给药期间，动物食欲良好，实验结束时无一体重减轻，且略有增加，亦无一死亡。仅在犬的高剂量组中有一只出现厌食、白细胞明显上升，尿素氮上升，但停药后即恢复，实验结束动物处死作病理检查，肉眼及镜检未见重要脏器发生明显病变，高剂量组肝脏有中度充血、肝细胞呈弥漫性浊肿，未见有坏死病灶。低剂量组的肝脏仅有轻度充血，停药10天后均恢复正常。
    3．特殊毒理研究(三致试验)
    进行了Alnes(艾姆氏)实验，微核实验，染色体畸变试验，结果证明蕲蛇酶无致突变作用。小鼠致畸的试验，亦为阴性，说明蕲蛇酶无致畸作用。
（下一页）